作者
北京大学第三医院
摘要
目的
探讨miR-375对人胚胎干细胞（hESC）定向分化为胰岛素分泌细胞（IPCs）的调控作用及其潜在机制。
方法
体外诱导hESC定向分化为IPCs，分析miR-375与其预测靶基因肝细胞核因子1β（HNF-1β）之间表达水平的动态变化关系；以miR-375过表达的慢病毒载体感染分化第二阶段细胞，实验分为空白对照组、阴性对照（GFP）组及miR-375过表达组；应用实时定量PCR和（或）Western blotting法检测各组分化细胞中miR-375、HNF-1β、胰岛细胞分化或功能相关的关键基因的表达。两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析和Q检验。
结果
hESC分化五个阶段中miR-375表达水平呈先高后低的变化趋势，相对表达量分别为100%、(472.25±33.53)%、(768.00± 25.65)%、(54.25±5.74)%、(30.75±5.70)% (F=1137.57，P<0.001)。 HNF-1β表达水平在分化第三阶段开始明显上升，在分化第四阶段达到高峰[分别为（279.50±21.30)%、(645.00±64.55)%，F=224.86，P< 0.001]，变化趋势与1/miR-375的变化趋势相似。慢病毒感染后，miR-375过表达组的HNF-1β mRNA表达水平与GFP组、空白对照组无显著差异(F=1.467，P>0.05)，而miR-375过表达组的HNF-1β蛋白表达水平则下降至GFP组的（38.75±9.22)% (F=60.69，P<0.001)。与GFP组相比，miR-375过表达组分化第四阶段细胞的胰十二指肠同源盒因子1(Pdx-1）表达水平显著升高，分化第五阶段细胞（IPCs）的Nkx6.1、配对盒因子4(Pax-4）及胰岛素的表达水平则显著降低(F=105.19~484.05，均P<0.001)。
结论
miR-375对hESC向IPCs定向分化具有重要的调控作用，该作用可能是通过影响转录因子HNF-1β表达而实现的。
人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESC）定向分化为胰岛素分泌细胞（insulin producing cells，IPCs）技术是糖尿病细胞替代治疗的关键环节，但现有体外诱导方案所获得的IPCs并非真正成熟的胰岛β细胞，因此有必要探讨调控该分化过程的分子机制，以期优化现有的诱导分化策略。miRNA是一种长度在19~22个核苷酸的非编码小分子RNA，主要在转录后水平负性调控靶基因的表达。研究显示，一些特定的miRNA参与调控胰腺的胚胎发育过程[1]。本课题组既往的研究证实，多种miRNA在成人胰岛中的表达水平高于hESC及其诱导分化获得的IPCs，其中miR-375表达水平的差异最为显著，提示其可能对胰岛β细胞成熟或分泌功能相关的基因具有调控作用[2]。本研究探讨miR-375对hESC分化为IPCs的影响及其可能机制。
材料与方法
一、实验材料
hESC系PKU1.1为北京大学第三医院临床干细胞研究中心自主建系[3,4]。各种细胞培养基购自美国Gibco公司，全反式维甲酸（RA）、胶原酶Ⅳ、烟酰胺及Trizol购自美国Sigma公司，其他生长因子购自美国Peprotech公司。利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司提供。逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司，实时定量PCR试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。引物由北京奥科生物技术公司合成。慢病毒载体构建、滴度测定由美国Invitrogen公司完成。多克隆兔抗人肝细胞核因子1β（HNF-1β）抗体和小鼠单克隆抗人3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体购自美国Santa Cruz公司。
二、实验方法
1．hESC的培养和诱导分化：
采用本课题组建立的定型内胚层途径改良五步法方案[5,6]，培养和诱导hESC向IPCs定向分化，第一阶段为hESC的培养和扩增；第二阶段（分化第0~4天），将hESC培养于含100 µg/L活化素A和1 µmol/L渥曼青霉素（wortmannin）的DMEM/F12培养基中，诱导其形成定型内胚层；第三阶段（分化第5~8天），添加含2 µmol/L RA、20 µg/L成纤维细胞生长因子7(FGF7）、50 µg/L NOGGIN及0.25 µmol/L KAAD-环杷明（KAAD-cyclopamine）的IMDM /F12培养基，诱导形成胰腺前体细胞；第四阶段（分化第9~13天），在含50 µg/L表皮生长因子（EGF）的DMEM培养基中培养扩增胰腺前体细胞；第五阶段（分化第14~20天），添加含10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10 mmol/L烟酰胺、10 nmol/L利拉鲁肽及10 µg/L骨形态发生蛋白4(BMP-4）的DMEM/F12培养基，诱导胰腺前体细胞分化为IPCs。
2．慢病毒感染：
（1）慢病毒载体的构建：从miRBase数据库获得miR-375序列，构建miR-375过表达的慢病毒载体并且进行滴度检测，获得慢病毒重组质粒和对照空载体病毒质粒。（2）慢病毒感染：以最佳感染条件（即感染复数值50）感染细胞。病毒感染48 h后，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，证明细胞感染成功。实验分为空白对照组（未感染组）、阴性对照组[仅感染绿色荧光蛋白（GFP）组，简称为GFP组]、miR-375过表达组（感染miR-375组），每组3个复孔，重复4次实验。在荧光显微镜下观察GFP荧光并拍照，用Image-Pro Plus专业图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）计算感染效率。应用实时定量PCR检测各组miR-375的表达水平，以验证miR-375过表达效果。
3．实时定量PCR分析：
收集分化各阶段细胞提取总RNA。（1）miRNA表达的分析：将miRNA 3'端进行Poly(A)处理后逆转录为cDNA；实时定量PCR反应总体系20 μl, U6作为内参照，反应条件：94 ℃起始模板变性2 min, 94 ℃PCR循环中模板变性20 s，循环40~45次，60 ℃退火延伸34 s，55~95 ℃熔解曲线10 s，循环81次，设3个平行孔。（2）mRNA表达的分析：按照Fermentas公司逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA；实时定量PCR反应总体系20 μl, GAPDH作为内参照。采用iQ5 real time PCR仪（美国Bio-Rad公司）扩增DNA和收集荧光信号，采用Livak法（即计算2-ΔΔCt）计算目的基因表达量。目的基因和内参照基因的引物序列、退火温度及产物长度分别为：miR-375：上游：5'-GCGTTTGTTCGT TCGGCTC-3'，下游：通用序列，60 ℃，67 bp；U6：上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，60 ℃，66 bp；HNF-1β：上游：5'-CTCCCAGCATCTCAACAAGG-3'，下游：5'-CTGTCTGGTTGAATTGTCGG-3'，58 ℃，110 bp；Pdx-1：上游：5'-CCCTCCTACAGCACTCCACC-3'，下游：5'-CCGCTGTGTGTGTTAGGGAG-3'，64 ℃，106 bp；Nkx6.1：上游：5'-AGACCCACTTTTTCCGGACA-3'，下游：5'-CCAACGAATAGGCCAAACGA-3'，58 ℃，103 bp；Pax-4：上游：5'-CTTTGTGCTGAAGGGCTT TG-3'，下游：5'-GGTAGTCCCTGGTCCTCCTG-3'，58 ℃，95 bp；胰岛素：上游：5'-CAGATCACTGTCCT TCTGCC-3'，下游：5'-GTTGGTTCACAAAGGCTGC G-3'，62 ℃，105 bp；GAPDH：上游：5'-TGCACCACC AACTGCTTAGC-3'，5'-GGCATGGACTGTGGTCAT GAG-3'，60 ℃，87 bp。
4．Western blotting分析：
裂解细胞提取蛋白样品。样品变性后进行电泳、转膜、电转，一抗4 ℃过夜孵育（多克隆兔抗人HNF-1β抗体1∶300，小鼠单克隆抗人GAPDH抗体1∶1 000），二抗（IRDye800CW标记山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG 1∶10 000）室温避光孵育2 h。Odyssey双红外荧光扫描成像系统（美国LI-COR Biosciences公司）检测荧光条带并分析灰度。
三、统计学方法
采用SPSS 11.5软件进行分析，数据均以±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析和Q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、hESC分化过程中miR-375及其靶基因HNF-1β表达水平的动态变化
实时定量PCR分析显示，miR-375在第一阶段（hESC）细胞中可见表达（100.00%)，其表达水平从细胞分化第二阶段开始明显上升，第三阶段末达到高峰，第四阶段开始下降，直至分化末期第五阶段降至最低，相对表达量分别为（472.25±33.53)%、(768.00±25.65)%、(54.25±5.74)％及（30.75±5.70)%，差异均有统计学意义(F=1137.57，P<0.001)。因miRNA负性调控靶基因的表达，故本研究采用miR-375倒数（1/miR-375）方式表示，以便更直观地显示两者间的动态变化关系。结果显示，第一阶段细胞1/miR-375处于较低水平（100%)，分化第二、三阶段有所降低，分化第四阶段开始升高，至分化第五阶段IPCs形成时其水平迅速上升至最高峰，相对水平分别为21.2% ±1.5%、13.0% ±0.4%、185.9%±19.3％及334.3%±65.5%，差异均有统计学意义(F=76.42，P<0.01)。
应用TargetCombo软件（http://www.diana.pcbi. upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi）预测miR-375的靶基因，可见HNF-1β基因的3'UTR第323-330位核苷酸与miR-375互补，且该序列在人、小鼠、大鼠等物种中存在保守性（表1）。实时定量PCR分析显示，HNF-1β表达水平在hESC分化早期处于较低水平，变化趋势与miR-375的变化趋势相似；而在分化第三阶段开始明显上升，在分化第四阶段达到高峰，其变化趋势与1/miR-375的变化趋势相似。相对表达量在分化第一阶段到第五阶段分别为100.00%、(140.25±18.63)%、(279.50±21.30)%、(645.00±64.55)％及（570.50±22.94)%，差异均有统计学意义(F=224.86，P<0.001)。
二、慢病毒感染hESC分化细胞过表达miR-375
在分化第二阶段细胞中进行慢病毒感染实验，荧光显微镜下计数GFP阳性细胞数量并计算感染效率。结果显示，在慢病毒感染48 h后，miR-375过表达组与GFP组之间的感染效率相似（图1），分别为（82.25±9.32)％和（79.75±1.26)% (t=0.53，P=0.014)。实时定量PCR分析显示，miR-375过表达组、GFP组及空白对照组之间miR-375表达水平差异有统计学意义(F=578.07，P<0.001)，其中miR-375过表达组的miR-375表达水平是GFP组的（1.99± 0.07）倍(P<0.05)，而GFP组与空白对照组之间的miR-375表达水平则未见显著差异(P=0.37)。
三、过表达miR-375对HNF-1β表达的影响
实时定量PCR分析显示，miR-375过表达组的HNF-1β mRNA表达水平［(100.98±4.02)%］与GFP组（100.00%)、空白对照组［(107.75±11.38)%］无显著差异(F=1.467，P=0.28)；Western blotting分析显示，miR-375过表达组、GFP组及空白对照组之间HNF-1β蛋白表达水平差异有统计学意义(F=60.69，P< 0.001)，其中miR-375过表达组的HNF-1β蛋白表达水平下降至GFP组的（38.75±9.22)% (P<0.001)，而GFP组与空白对照组之间的HNF-1β蛋白表达水平则未见显著差异(P=0.72，图2）。
注：GFP：仅感染绿色荧光蛋白组；miR-375：miR-375过表达组；HNF-1β：肝细胞核因子1β；GAPDH: 3-磷酸甘油醛脱氢酶
四、过表达miR-375对胰岛细胞分化或功能相关基因表达的影响
实时定量PCR分析显示，分化第四阶段细胞（胰腺前体细胞）的胰十二指肠同源盒因子1(Pdx-1）表达水平在GFP组、空白对照组及miR-375过表达组之间存在显著差异(F=412.15，P<0.001)，分化第五阶段细胞（IPCs）的Nkx6.1、配对盒因子4（Pax-4）及胰岛素的表达水平在三组间也均有显著差异(F=484.05、105.19、157.85，均P<0.001)，其中Pdx-1表达水平在miR-375过表达组中显著高于GFP组[(164.75±2.87)％比100%，P<0.001]，而Nkx6.1、Pax-4及胰岛素的表达水平在miR-375过表达组中则显著低于GFP组［(49.25±3.77)%、(72.75±4.55)%、(73.18±1.14)％比100%，均P<0.001]。
讨论
采用定型内胚层途径的改良五步法方案，可成功诱导hESC定向分化为IPCs。实时定量PCR分析显示，miR-375在hESC定向分化过程中呈先高后低的表达变化规律。慢病毒感染实验显示，miR-375过表达可抑制靶基因HNF-1β的蛋白表达，促进胰腺前体细胞标志物Pdx-1的表达，抑制胰岛成熟相关标志物Nkx6.1和Pax-4的表达，并减少胰岛素的表达。上述结果提示，miR-375在hESC分化为IPCs过程中发挥调控作用。
miR-375基因定位于人类2号染色体和小鼠1号染色体。研究证实，miR-375参与调控胰腺的胚胎发育过程。我们既往的研究发现，miR-375在成人胰岛中的表达水平显著高于hESC和诱导分化获得的IPCs[2]。另有研究显示，抑制miR-375表达可导致胰腺发育异常，胰岛形态结构散乱[7]，α和β细胞总量降低，并出现胰岛素分泌减少和血糖升高[8]。在胎儿胰腺早期发育过程中miR-375的表达水平逐步升高，随后出现下降趋势[9]。本研究显示，miR-375在hESC定向分化过程中呈现先升高后降低的表达特点，其变化趋势与人胚胎胰腺发育中的变化趋势相一致[9]。
采用生物信息学方法进行靶基因预测发现，转录因子HNF-1β是miR-375重要的靶基因。实时定量PCR分析显示，HNF-1β在hESC分化早期处于较低水平，变化趋势与miR-375的变化趋势相一致；而在分化第三阶段HNF-1β表达开始上调，在分化第四阶段达到峰值，变化趋势与miR-375倒数的变化趋势相一致。上述结果提示，HNF-1β在细胞分化早期可能受miR-375影响较小，或可能更多受到其他信号分子的调控，而在分化第三阶段开始则主要受到miR-375的负性调控。慢病毒感染实验显示，在细胞分化第二阶段过表达miR-375对HNF-1β的mRNA水平无显著影响，但可显著抑制其蛋白的表达，提示miR-375在转录后水平上负性调控HNF-1β蛋白的表达。
业已证实，HNF-1β参与内胚层和胰腺前体细胞的发育，参与葡萄糖代谢途径多种相关基因的调控，对Pdx-1、Nkx6.1、Pax-4、胰岛素等多个基因均可发挥调节作用[10,11,12,13]。Pdx-1在胰腺发育的全过程中均有表达，是胰腺发育和胰腺前体细胞分化为胰岛β细胞的主要调控因子；在成熟胰岛β细胞中，Pdx-1也是胰岛素基因表达的调控因子。Nkx6.1是早期胰腺上皮的标志物，仅在胎儿胰岛β细胞中表达，对于β细胞的最终分化和功能调控是必需的。Pax-4则是胰岛成熟相关标志物。本研究显示，miR-375过表达可促进Pdx-1的表达，抑制胰岛成熟相关标志物Nkx6.1和Pax-4的表达，减少胰岛素的表达。上述结果提示，过表达miR-375可能通过抑制转录因子HNF-1β的表达，进而调控hESC向IPCs的分化。
综上所述，miR-375在hESC向IPCs诱导分化中发挥重要的调控作用，该作用可能是通过调控转录因子HNF-1β表达而实现的。因此，改变miR-375表达的方法可能有助于建立诱导hESC向IPCs定向分化的新方案。
