标题：Analysis of Polyphenol Extract from Hazel Leaf and Ameliorative Efficacy and Mechanism against Hyperuricemia Zebrafish Model via Network Pharmacology and Molecular Docking
期刊：Molecules
原文链接：https://doi.org/10.3390/molecules29020317
摘要
榛子叶是榛子的副产品，在葡萄牙、瑞典、伊朗等地区的传统民间医学中常被用于血管保护、止血、抗水肿、抗感染和止痛等功效。基于我们之前的研究，通过高效液相色谱指纹图谱对榛子叶中的多酚提取物进行了鉴定和定量分析。初步测定了榛子叶多酚提取物（ZP）中槲皮素、绿原酸、杨梅素、咖啡酸、对香豆酸、白藜芦醇、木犀草素、没食子酸和鞣花酸等9种化合物的含量，其中槲皮素含量最高，为221.99毫克/克，其次是绿原酸，含量为8.23毫克/克。采用化学方法测定了ZP对α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用，发现其对黄嘌呤氧化酶的抑制效果更佳。随后，研究了ZP对高尿酸血症斑马鱼的影响，结果表明ZP能显著降低高尿酸血症斑马鱼的尿酸、黄嘌呤氧化酶、尿素氮和肌酐水平，并上调OAT1和HPRT基因的表达。最后，对9种多酚化合物进行了靶向网络药理学分析和分子对接，以探寻其缓解高尿酸血症的相关机制。这些结果将为榛子叶多酚作为功能成分的开发和应用提供有价值的依据。
关键词：榛子叶；多酚提取物；高尿酸血症；斑马鱼
引言
榛子属于桦木科榛属，原产于欧洲和西亚，在北美也有栽培。榛子是世界上最受欢迎的坚果之一，含有蛋白质、脂肪酸、膳食纤维和多酚等营养成分及生物活性物质。从榛子仁中提取的可溶性膳食纤维具有理想的保水性、保油性和降 swelling 特性，可缓解高血脂和肥胖症。榛子油富含油酸、生育酚、生育三烯酚等植物甾醇，通过调节bax/bcl-2转运机制可诱导结肠癌细胞死亡。近年来，随着榛子种植面积的不断扩大，产生了大量副产品，包括榛子壳、果壳和叶子。由于现代农业和食品加工业对榛子的果仁部分较为青睐，其副产品被视为废弃物，缺乏优化利用，导致浪费较多、资源消耗较大。因此，为避免大量榛子副产品对环境造成压力，有必要对这些副产品进行全面研究，并利用它们解决人类生活中的一些问题。榛子叶作为榛子的副产品之一，在世界上许多国家和地区被广泛应用于传统医学和民间医学中。在传统伊朗医学中，榛子叶被用作肝脏多酚是最大的一类植物化学物质，广泛存在于水果和蔬菜等植物性食物中。大量研究表明，富含水果和蔬菜的饮食与由氧化应激引起的疾病（如心血管疾病、肥胖症、糖尿病和高尿酸血症）呈负相关。其中，高尿酸血症（HUA）是一种因尿酸生成过多和排泄减少引起的代谢性疾病。 在民间医学中，多酚具有强身健体以及治疗痔疮、静脉曲张、静脉炎和轻度水肿的功效。在传统瑞典医学中，榛树叶被用于止痛。在葡萄牙民间医学中，榛树叶也被用于治疗静脉曲张和痔疮。目前的研究以及我们之前的研究表明，榛树叶的主要成分是多酚，其具有明显的抗氧化、抗炎和抗菌活性。
多酚作为最大的一类植物化学物质，广泛存在于水果和蔬菜等植物性食物中。大量研究表明，富含水果和蔬菜的饮食与氧化应激引起的疾病（如心血管疾病、肥胖症、糖尿病和高尿酸血症）呈负相关。其中，高尿酸血症（HUA）是一种因体内尿酸生成过多和代谢异常而引起的代谢性疾病，可能导致痛风、心血管疾病和肾衰竭。有报道称，尿酸可通过细胞内溶酶体破裂产生的尿酸盐结晶以及线粒体产生的活性氧激活炎症小体通路。此外，黄嘌呤氧化酶诱导的氧化应激可直接或间接升高血清尿酸浓度。本文对榛子叶多酚提取物的主要成分进行了定量分析，并利用高尿酸血症斑马鱼模型和靶向网络药理学验证了榛子叶多酚对高尿酸血症的作用及相关机制。这可能为榛子叶多酚在功能性食品或药物添加剂中的应用提供进一步的实验依据。
结果
高效液相色谱分析
采用高效液相色谱香豆酸、咖啡酸、绿原酸、没食子酸、木犀草素、鞣花酸、山奈酚法测定酚类化合物的存在及含量（图S1）。因此，在3.063、12.067、16.262、25分钟的洗脱时间范围内，对不同的标准酚类化合物，即白藜芦醇和杨梅素进行了分析。对香豆酸、咖啡酸、绿原酸、没食子酸、木犀草素、鞣花酸、山奈酚和杨梅素的洗脱时间范围进行了分析，分别为3.063、12.067、16.262、25.118、33.688、35.988、37.246、39.546和49.856分钟，如图1所示。ZP中各种测定化合物的含量也通过峰面积计算，结果如表1所示。数据显示，山奈酚含量最高，为221.9947 mg/g，其次是绿原酸和杨苷，香豆酸含量最低，仅为0.0179 mg/g。
α-葡萄糖苷酶的抑制作用
如图2B所示，与阳性对照组的别嘌醇相比，在0–14 µg/mL浓度范围内，榛子叶多酚提取物的抑制率从11%上升至93%，且在12 µg/mL时抑制率达到最大值。14 µg/mL浓度下的抑制率与12 µg/mL时相当。榛子叶多酚提取物的半数抑制浓度（IC50）为8.257 nM，低于对照组的9.538 nM。这些结果表明，榛子叶多酚提取物对XOD具有非常显著的抑制作用，甚至优于阳性对照药物别嘌醇。
ZP对高尿酸血症斑马鱼的影响
ZP对高尿酸血症斑马鱼尿酸和黄嘌呤氧化酶的影响
如图3A所示，与对照组相比，高尿酸血症斑马鱼的尿酸水平显著升高（\((p<0.01)\)）。与模型组相比，别嘌醇显著降低了高尿酸血症斑马鱼的尿酸水平（\((p<0.01)\)）。高剂量ZP组（ZPH）和中剂量ZP组（ZPM）的尿酸水平也显著降低（\((p<0.01)\)）。然而，低剂量ZP组（ZPL）无显著差异。结果表明，榛子叶多酚提取物可降低体内尿酸含量。
XOD可在体内将次黄嘌呤和黄嘌呤氧化为尿酸[13]。因此，我们检测了高尿酸血症斑马鱼体内的XOD水平。如图3B所示，与对照组相比，高尿酸血症斑马鱼的XOD水平显著升高（\((p<0.01)\)）。与模型组相比，别嘌醇显著降低了高尿酸血症斑马鱼的XOD水平（<0.01）（\((p<0.01)\)）。ZPH、ZPM和ZPL组的XOD水平也显著降低（<0.01）（\((p<0.01)\)，0.01）。结果表明，榛子叶多酚提取物具有良好的XOD抑制作用，且高剂量组的效果与别嘌醇相似。
图3. ZP对高尿酸血症斑马鱼中UA、XOD、BUN和Cr的影响，（A）UA水平；（B）XOD水平；（C）BUN水平；（D）Cr水平。与对照组相比，## \(p<0.01\)。与模型组相比，\(^{*} p<0.05\) \(^{* *} p<0.01\)。与模型组相比。
ZP对高尿酸血症斑马鱼中BUN和Cr的影响
尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）是肾损伤的重要指标，可用于判断高尿酸血症是否会导致肾损伤。如图3C、D所示，模型组的BUN和Cr水平显著高于对照组（\((p<0.01)\)），表明尿酸升高会造成肾损伤。与模型组相比，别嘌醇显著降低了高尿酸血症斑马鱼的BUN和Cr水平（\((p<0.01)\) < 0.01）。ZPH组和ZPM组的BUN和Cr水平也显著降低（\((p<0.01)\)，p < 0.01）。ZPL组的BUN水平显著降低（\((p<0.05)\)），但Cr水平无显著差异。结果表明，榛叶多酚提取物可减轻高尿酸引起的斑马鱼肾损伤。
ZP对高尿酸血症斑马鱼中OAT1和HPRT1基因表达的影响
OAT1是一种主要存在于肾脏中的药物转运蛋白，其主要功能是排泄尿酸。HPRT1是嘌呤补救途径中最重要的酶。其功能缺陷会导致过量嘌呤分解为尿酸，这是血尿酸浓度升高的主要原因。如图4A、B所示，与对照组相比，模型组中OAT1和HPRT基因的表达显著降低。与模型组相比，ZPH、ZPM组中OAT1和HPRT1基因的表达显著上调。以及ZPL组（\((p<0.01)\)）。结果表明，榛子叶多酚提取物可使p < 0.01。结果表明，榛子叶多酚提取物能有效上调上述两个基因的表达。有效上调上述两个基因的表达。
网络药理学分析
预测的成分和疾病靶点
利用TCMSP数据库筛选9种酚类化合物的潜在靶点。去除重复值后，共获得109个药物靶点。在GeneCards数据库中挖掘高尿酸血症（HUA）靶点，经筛选、汇总并去除重复值后，得到907个疾病靶点。将药物靶点与疾病靶点进行交集映射，获得34个交集靶点（图5A）。
图5. 网络药理学的靶点分析，（A）共同靶点，（B）共同靶点的蛋白质相互作用，（C）核心靶点（节点越大、颜色越深表示度值越高）。
图4.（A）OAT1基因；（B）HPRT基因，### \(p<0.001\) \(## p<0.0001\) 与对照组比较。\(^{*} p<0.05\) \(^{* *} p<0.01\)，\(^{* * *} p<0.001\) 与模型组比较。图4.ZP对高尿酸血症斑马鱼OAT1和HPRT1基因表达的影响
蛋白质-蛋白质相互作用网络
将交集靶点导入STRING数据库以构建初始的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。如图5B所示，该PPI网络包含34个靶点、34个节点和289条边，平均节点度为17，局部聚类系数为0.779，PPI富集值为\(p -value <1.0 ×10^{-16}\)。通过Cytoscape 3.9.0可视化软件确定了核心靶点VEGFA、MYC、CASP3、MDM2、PPARG、IL-6、ESR1、NF-κB和BRCA1（图5C）。
基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析
将交集目标上传至DAVID数据库，进行GO和KEGG通路富集分析。分析数据结果按p值排序，并以\(p<0.001\)作为筛选和分析的阈值。GO分析显示有498个生物过程（BP）、14个细胞组分（CC）和36个分子功能（MF）。如图6A所示，主要的BP分析包括对激素的应答、对无机物的应答以及凋亡信号通路的调控。主要的CC分析包括转录调节复合物、死亡诱导信号复合物和Bcl-2家族蛋白复合物。主要的MF分析包括泛素蛋白连接酶结合、类泛素蛋白连接酶结合以及DNA结合转录因子结合。KEGG分析富集了前35条信号通路，包括脂质与动脉粥样硬化、TNF信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、NOD样受体信号通路、凋亡、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、p53信号通路以及其他与高尿酸血症（HUA）相关的潜在通路（图6B）。
图6。（B）KEGG分析的前35个结果。
对前期结果中得到的9个核心靶点和9个关键活性成分进行分子对接。使用MOE 2019.0102进行分析，配体-受体结合能与亲和力呈负相关。当靶点结合分数小于-7千卡/摩尔时，表明相应化合物与该靶点具有较高的结合能力[17]。最终，筛选出绿原酸、咖啡酸、没食子酸和木犀草素，进一步与BRCA1（PDB ID:1LOB）、CASP3（PDB ID:7RN7）、NFKBIA（PDB ID:1IKN）和VEGFA（PDB ID:1MGV）进行分析。化合物与靶点的结合位点及结合形式如表2所示。如图7A、B所示，绿原酸的两种不同构象通过赖氨酸C145结合位点的H-受体键与BRCA1结合；图7C中，绿原酸通过谷氨酸D138结合位点的H-供体键与NFKBIA结合。图7D显示，咖啡酸在赖氨酸B242结合位点与CASP3结合。图7E中，木犀草素通过赖氨酸C145结合位点的H-受体键与BRCA1结合。图8A中，没食子酸在赖氨酸结合位点与CASP3形成H-受体键。图8B显示，没食子酸在谷氨酸结合位点与NFKBIA形成H-供体键。图8C、D显示，没食子酸的两种不同构象通过谷氨酸A64和赖氨酸A48结合位点的H-供体键和H-受体键与VEGFA结合。这些结果表明，这四种化合物可能通过靶向相应靶点对高尿酸血症（HUA）发挥抑制作用。
图8. ZP关键活性成分与核心靶点之间的3D（左）和2D（右）结合构象，（A）没食子酸-CASP3，（B）没食子酸-NFKBIA，（C）没食子酸-VEGFA（构象1），（D）没食子酸-VEGFA（构象2）。
讨论
榛子叶是榛子的主要副产品之一。一些研究表明，榛子叶提取物中含有二芳基庚烷、黄酮醇苷、山奈酚和杨芽黄素。另一项研究显示，在三种榛子叶的水提物中鉴定出了八种酚类化合物，如咖啡酰酒石酸、对香豆酰酒石酸和杨苷类鼠李糖苷。同样，我们之前的研究在榛子叶的游离态、结合态和键合态酚类组分中鉴定出了35种酚类成分，包括酚酸、黄酮类和儿茶素[8]。在以往研究的基础上，采用外标法测定了榛子叶多酚提取物中九种酚类化合物的含量，其中山奈酚含量最高，其次是绿原酸和杨梅素。已有研究表明，山奈酚可通过抑制细胞凋亡保护脑缺血再灌注损伤细胞，并通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡]。它还是一种雌激素受体调节剂，可通过抑制炎症和凋亡，激活G蛋白偶联雌激素受体（GPER）及PI3K/AKT/Nrf2通路，改善绝经后小鼠的动脉粥样硬化。它在脂多糖诱导的帕金森病小鼠中也显示出神经保护作用，可减轻脂质氧化应激和线粒体损伤。绿原酸通过调控MAPK/ERK/JNK通路，减轻右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠黏膜损伤、炎症和氧化应激]。杨梅素作为一种补充剂，对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠有积极作用。它可通过调控与粪便丁酸盐相关的肠道菌群，减少肝脏脂质合成和炎症。然而，近年来关于多酚改善高尿酸血症的研究较少。本研究前期已证实榛子叶多酚提取物对黄嘌呤氧化酶（XOD）和α-葡萄糖苷酶（α-GLU）有抑制作用，且对XOD的抑制效果优于α-GLU。XOD是一种低特异性酶，可催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸（UA）。体内尿酸生成过多或排泄受阻可能导致高尿酸血症。尿酸盐结晶在体内过度积累会引发痛风。因此，我们进一步研究了榛子叶多酚提取物对高尿酸血症斑马鱼的影响。经榛子叶多酚提取物处理后，高尿酸血症斑马鱼的尿酸、黄嘌呤氧化酶、肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平其以剂量依赖的方式显著降低。次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）对嘌呤合成有反馈抑制作用。其缺乏会导致莱施-奈恩综合征，该疾病的特征为高尿酸血症、严重的运动障碍、舞蹈症、球蛋白病以及认知和注意力缺陷。临床上缺乏HPRT的患者会出现不同程度的痛风和神经系统疾病。有机阴离子转运蛋白1（OAT1）是肾脏中的一种多特异性药物转运蛋白，参与尿酸的排泄[。在斑马鱼中，HPRT和OAT1基因与人类的相似度分别为91%和46%。本研究中，高尿酸血症斑马鱼的HPRT和OAT1基因表达明显下调。给予榛子叶多酚提取物后，这两个基因的表达明显上调。这些结果表明，榛子叶多酚提取物可通过抑制嘌呤合成和黄嘌呤氧化酶活性来减少尿酸生成，并通过促进尿酸转运蛋白来加速其排泄。
此外，研究还采用靶向网络药理学和分子对接分析方法，探究了ZP治疗高尿酸血症（HUA）的分子机制。KEGG分析表明，ZP可能通过肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、核因子-κB（NF-κB）信号通路、晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体（AGE-RAGE）信号通路以及白细胞介素-17（IL-17）信号通路改善高尿酸血症。高尿酸血症的重要特征是体内尿酸（UA）水平升高。尿酸进入细胞后会发挥促氧化作用，增加活性氧（ROS）的产生。持续的氧化应激会诱导炎症细胞因子的产生，进而影响多个器官，包括导致肾脏损伤[28]。TNF-\(###\)主要在周围组织中产生，通过参与活性氧的生成以及多种转录介导通路的激活，诱发组织特异性炎症[29]。在肾小管上皮细胞（NRK-52E）和高尿酸血症小鼠中，尿酸会诱导肾小管间质的炎症细胞浸润，上调炎症细胞因子TNF-\(- \alpha\)的产生，并通过NF-κB信号通路调节活化正常T细胞分泌因子的表达[30]。其他研究表明，抑制AGE-RAGE和IL-17通路的激活，可改善高尿酸血症引起的肾脏炎症和细胞凋亡[31]。此外，我们还预测了ZP作用于高尿酸血症的核心靶点，如血管内皮生长因子A（VEGFA）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（CASP3）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、白细胞介素6（IL-6）、雌激素受体1（ESR1）和NF-κB。有研究显示，通过阻断髓样分化因子88（Myd88）/NF-κB通路来调节小鼠血清中炎症因子IL-6和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的表达，可改善高尿酸血症介导的认知功能障碍小鼠的神经元凋亡和小胶质细胞活化。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是细胞凋亡的特征性靶点，下调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达可预防高尿酸血症诱导的肾损伤中的氧化应激和线粒体凋亡。研究表明，靶向VEGFA可通过调节信号转导及转录激活蛋白3（STAT3）信号通路来抑制炎症和氧化应激，从而延缓高尿酸血症诱导的慢性扩张性肾纤维化进展、改善肾功能衰竭并降低血清尿酸水平。PPARG是核受体超家族的成员，主要通过与NF-κB信号通路相互作用来抑制炎症[。雌激素受体1（ESR1）和雌激素受体2（ESR2）基因分别编码雌激素受体α和雌激素受体β。一项临床试验证实了ESR1与高尿酸血症的相关性，且ESR1基因的rs712221多态性会影响减重手术患者血清尿酸水平的降低]。为进一步探究ZP潜在的分子机制，我们筛选了4种活性成分和4个核心靶点进行分子对接。结果显示，这些成分与乳腺癌易感基因1（BRCA1）、CASP3、核因子κB抑制蛋白α（NFKBIA）和VEGFA具有较高的亲和力。绿原酸、咖啡酸、没食子酸和木犀草素可能是ZP发挥高尿酸血症保护作用的关键化合物。这些结果为今后榛子叶多酚提取物治疗高尿酸血症的研究提供了更多启示和方向。
结论
本研究在前期研究结果的基础上，采用高效液相色谱法（HPLC）对榛子叶多酚提取物中的9种化合物进行了定量分析。通过体外实验比较了榛子叶多酚提取物对α-葡萄糖苷酶（α-GLU）和黄嘌呤氧化酶（XOD）的抑制作用，发现其对XOD的抑制效果更佳。由此推测，榛子叶多酚提取物可能对高尿酸血症（HUA）具有治疗作用。为此，构建了高尿酸血症斑马鱼模型，证实榛子叶多酚提取物能有效降低高尿酸血症斑马鱼体内尿酸（UA）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的水平，并上调有机阴离子转运体1（OAT1）和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）基因的表达。最后，通过靶向网络药理学和分子对接技术预测了榛子叶多酚提取物的潜在分子机制，为进一步研究奠定了基础。关于榛子叶多酚提取物治疗高尿酸血症的研究。这也有助于对榛子副产品——榛子叶的可持续开发与利用。
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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。
木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。
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